Larry Daley (Ben Stiller) ist ein erfolgloser Erfinder und hat Probleme sein Leben in den Griff zu bekommen. Um wieder ein Bein auf die Erde zu bekommen und um regelmäßig seinen Sohn sehen zu dürfen, nimmt er einen Job als Nachtwächter im National History Museum of New York an, doch hier fangen seine Probleme erst richtig an.
Das große und stille Gebäude birgt ein seltsames Geheimnis und der neue Job eine viel größere Verantwortung als anfangs gedacht: Nachts erwacht hier alles zum Leben, ob Soldaten aus der Antike oder das gigantische Skelett eines Tyrannosaurus Rex. Larry wird bewusst, dass seine Arbeit daraus besteht das verrückte Treiben im Zaum zu halten, was sich als ziemlich schwer heraus stellt. Nur Theodore Roosevelt (Robin Williams) steht dem verzweifelten Larry zur Seite, schließlich geht es darum das Museum zu retten und Larrys Sohn zu beweisen, dass sein Vater kein Versager ist.